D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Coccodes jamur fitopatogenik Colletotrichum nyebabake penyakit sing mbebayani ing kentang lan tomat sing dikenal minangka bintik ireng antraknosa lan umbi. Kanthi ciri morfologis, asring angel dibedakake karo penyakit sing disebabake dening mikroorganisme liyane; ing woh tomat ijo, penyakit iki bisa uga asimtomatik, mung diwujudake ing woh-wohan abang sing mateng. Kanggo diagnosis patogen sing cepet lan akurat, ditawakake sistem tes PCR wektu nyata. Kanggo nggawe sistem tes, urutan nukleotida glikol trifosfat dehidrogenase gen 45 C. galur coccodes sing diisolasi saka umbi kentang ing macem-macem wilayah ing Rusia ditemtokake.
Adhedhasar asil sing dipikolehi lan analisis urutan sing padha karo spesies liyane sing kasedhiya ing basis data GenBank, dirancang khusus primer spesies lan probe kanggo C. coccode. Kanggo mriksa kekhususan sistem tes sing digawe, PCR ditindakake kanthi DNA sing diisolasi saka budaya murni saka 15 jinis jamur parasit lan saprotrofik sing ana gandhengane karo tanduran tomat lan kentang (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Anane DNA coccodes Colletotrichum ditemtokake ing siklus ambang 20-27, dene spesies liyane dideteksi sawise 40 siklus utawa ora dideteksi. Sistem tes bisa dipercaya ndeteksi konsentrasi DNA C. coccodes luwih saka 0.01 ng / mm3 ing campuran PCR sing dianalisis. Nggunakake sistem tes sing dikembangake, investigasi C. coccode ing godhong tomat kanthi gejala penyakit jamur lan umbi kentang tanpa gejala eksternal sing diteliti. Godhong kanthi gejala infeksi jamur diklumpukake saka rong lapangan ing Wilayah Krasnodar, umbi - saka lapangan ing wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Siji godhong tomat sing ngemot C. coccodes DNA ditemokake ing Wilayah Krasnodar; anane DNA patogen sing signifikan iki dideteksi ing 5 conto umbi sing ditandur ing wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga.
Pambuka
Jamur saka genus Colletotrichum minangka fitopathogens sing mbebayani sing nyebabake sereal, sayuran, jamu, woh-wohan perennial lan tanduran berry. Salah sawijining spesies ing endi-endi ing genus iki, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, minangka agen penyebab antraknosis lan titik ireng kentang lan tomat, lan nyebabake penyakit sawetara tanduran liyane saka kulawarga Solanaceae, kalebu. suket (Dillard, 1992). C. coccodes nginfeksi kabeh bagean lemah ing tanduran, pangkalan batang, godhong, lan woh-wohan (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Ing kulit umbi kentang sing kena infeksi, diamati pangembangan bintik-bintik abu-abu kanthi pojokan sing ora jelas, ing endi titik ireng sporulasi lan mikrosklerotia katon jelas. Sajrone panyimpenan, ulkus kanthi isi sing alus bisa dibentuk ing pulp umbi, yaiku penyakit kasebut mlebu ing tahap antrasnosa, nanging, arang banget.
Sanalika, gejala antrasnosa (ulkus kulit kanthi titik ireng cilik) khas ing woh tomat. Ing godhong, gejala C. coccode katon minangka bintik coklat peteng, biasane dibatesi karo jaringan kuning (Johnson, 1994).
Pangembangan titik ireng ing umbi ngrusak tampilan, sing utamane pocapan nalika adol kentang abang sing dikumbah. Pengelupasan kulit nyebabake penguapan sing berlebihan lan nambah kerugian panyimpenan (Hunger, McIntyre, 1979). Kerusakan organ tanduran liya nyebabake kerugian panen, sing kacathet ing lemah terbuka lan tertutup (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Penyakit sing disebabake dening C. coccode umume ing meh kabeh wilayah sing ngasilake kentang ing saindenging jagad, kalebu Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrol penyakit kasebut angel amarga ora efektifitas fungisida sing ana ing C. coccode lan kekurangan varietas resisten (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes bisa tetep ana ing umbi wiji (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), wiji tomat (Ben-Daniel et al., 2010), tahan suwe ing lemah, ing lebu tanduran (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) lan suket (Raid, Pennypacker, 1987). Karya-karya sawetara penulis (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) nuduhake manawa pangembangan penyakit ing kentang lan tomat umume gumantung karo anané inokulum ing wiji lan lemah Mula, kanggo nyuda kerugian saka penyakit kasebut, kudu didiagnosis (kalebu kuantitatif) panyebaran jamur ing bahan wiji, ing lemah, ing umbi kentang wiji lan wiji tomat sing disimpen. Diagnostik morfologis ing lemah lan bahan tanduran bisa ditindakake mung kanthi anané mikrosklerotia, nanging uga ditemokake ing jinis jamur liyane.
Gejala ing umbi padha banget karo scab perak sing disebabake jamur Helminthosporium solani. Isolasi coccodes Colletotrichum lan Helminthosporium solani dadi budaya murni rada angel lan butuh wektu suwe amarga tuwuh alon ing medium nutrisi. Kanggo cepet ngenali coccode Colletotrichum, sampeyan kudu nggunakake metode diagnostik instrumental. Cara sing paling gampang yaiku reaksi rantai polimerase (PCR) lan modifikasi - PCR wektu nyata. Saiki, sistem tes sing dikembangake dening peneliti Inggris (Cullen et al., 2002) kanggo wilayah ITS1 rDNA digunakake ing Eropa lan Amerika Serikat. Panganggone nuduhake asil sing apik ing analisis isolasi Rusia (Belov et al, 2018). Nanging, coccodes C. beda-beda lan deteksi saka urutan DNA siji bisa nyebabake asil negatif sing salah. Kanggo diagnosis sing luwih dipercaya, perlu dianalisis sawetara urutan DNA khusus spesies, supaya bisa nggawe sistem tes asli sing ngidini kita ngenali coccode C. kanthi urutan gen glyceraldehyde-3-fosfat dehidrogenase.
Bahan lan cara
Kanggo netepake efektivitas lan kekhususan sistem tes sing digawe, kita nggunakake budaya murni saka 15 spesies jamur sing diisolasi dening panulis saka conto godhong lan buah tomat sing lara, umbi kentang (Tabel 1). Kanggo ngisolasi, kita njupuk organ tanduran kanthi gejala infeksi jamur, ora luwih saka siji organ per grumbulan.
Irisan umbi nganggo kulit, irisan woh tomat, lan godhong sing kena dilebokake ing sangisore mikroskop teropong, sawise miselium, spora, utawa potongan jaringan ditransfer menyang medium agar (wort agar) ing sajian Petri kanthi jarum sing dibuwang. Isolasi kasebut disimpen ing miring agar ing tabung uji ing 4 ° C.
Sampel godhong tomat kanthi gejala penyakit jamur sing ditrapake kanggo analisa, sawise dikoleksi (ing lapangan) diselehake ing 70% etil alkohol, mula disimpen nganti isolasi DNA. Ubi kentang dikirim menyang laboratorium, dikupas (potongan 2 × 1 cm), lan beku ing –20 ° C. Disimpen beku nganti isolasi DNA.
Budaya jamur murni kanggo isolasi DNA ditanam ing medium kacang polong cair. Miselium jamur dicopot saka medium cair, dikeringake ing kertas saring, beku ing nitrogen cair, homogenisasi, diinkubasi ing buffer CTAB, dimurnikan kloroform, diendhot karo campuran isopropanol lan 0.5 M kalium asetat, dicuci kaping pindho kanthi alkohol 2%. DNA sing diasilake dibubarake ing banyu sing deionisasi lan disimpen ing –70 ° (Kutuzova et al., 20). Konsentrasi DNA diukur nggunakake kit kuantifikasi DNA HS kanggo DNA terdampar kaping pindho ing Qubit 2017 (Qiagen, Jerman). Sampel alkohol lan beku triturasi ing nitrogen cair, banjur ekstraksi DNA ditindakake kanthi cara sing padha kaya sing dijelasake ing ndhuwur (kanggo miselium budaya jamur murni).
Tabel 1. Asal saka galur jamur sing digunakake
Jeneng jamur | Tanduran, organ | Papan pilihan |
---|---|---|
Coccodes colletotrichum 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | umbi kentang | Wilayah Kostroma, umbi kentang saka generasi kaping pisanan, kultivar Abang Scarlett |
Coccodes koletotrichum 4 | godhong kentang | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | umbi kentang | Wilayah Magadan, pos. Kémah, umbi kentang |
Fulgum Cladosporium | godhong tomat | Wilayah Moskow, tomat woh-wohan gedhe |
Tomatofila alternaria | woh tomat | diajukake dening staf laboratorium mikologi lan fitopatologi Institut Riset Tanduran Kabeh-Rusia |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | woh tomat | Wilayah Krasnodar, kabupaten Krymsky, krim tingkat |
Fusarium oxysporum | oyot gandum | Wilayah Moskow |
PCR ditindakake ing amplifier DTprime (DNA-Technology). Kanggo PCR, primer asli lan probe kanggo wilayah spesifik spesies gen glukol trifosfat dehidrogenase digunakake: maju primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, balik primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Primer nggedhekake wilayah 213 bp.
Reaksi kasebut njupuk 50 ng total DNA (nalika nganalisa godhong lan umbi) lan 10 ng (nalika nganalisis DNA budaya jamur murni). Campuran reaksi (35 μl) dipisahake karo lapisan parafin dadi rong bagean: sisih ngisor (20 μl) ngemot 2 μl buffer reaksi 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Antarane- 20), 0.5 mM saben trifosfat deoxynucleotide, 7 pmol saben primer, lan 4 pmol probe fluorescent sing bisa dihidrolisis; sisih ndhuwur ngemot 1 μl saka buffer PCR 10 × lan polimerase Taq 1 U.
Pemisahan campuran karo parafin ngidini tabung kanggo disimpen suwe ing suhu 5 ° C lan nyedhiyakake wiwitan panas kanggo PCR sawise digawe panas nganti 10 menit kanthi suhu ing ndhuwur 80 ° C. PCR ditindakake miturut program ing ngisor iki: 94.0 ° C - 90 s (1 siklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 siklus); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 siklus); 10.0 ° C - panyimpenan.
Asil lan diskusi
Urutan gen dehidrogenase trifosfat glycerol ditemtokake ing 45 galur sing diisolasi saka godhong, batang, umbi kentang, lan woh tomat (Kutuzova, 2018) ing macem-macem wilayah ing Rusia. Urutan sing ditliti kanggo kabeh galur dipérang dadi 2 klompok sing beda ing rong nukleotida. Urutan urutan nukleotida saka rong klompok kanthi angka KY496634 lan KY496635 disimpen ing GenBank.
Primer coc70gdf, coc280gdr lan probe cocgdz sing dirancang kanthi dhasar dicenthang nggunakake program BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) ing kabeh urutan gen glukol trifosfat dehidrogenase spesies genus Colletotrichum lan organisme liyane sing kasedhiya ing basis data GenBank.
Ora ditemokake wilayah DNA ing organisme liya sing homolog tumrap primer lan probe.
Sensitivitas sistem tes diperiksa nggunakake conto kanthi konsentrasi beda C. coccodes DNA, DNA saka godhong kentang sing kena infeksi antrasnosa (diklumpukake ing taun 2017 ing Mari El, macem-macem Red Scarlett), lan kulit umbi sing kena bintik ireng (diklumpukake ing wilayah Kostroma, macem-macem Abang Scarlett, Tabel 2). Kanggo ngonfirmasi anané DNA ing umbi-umbi lan godhong kentang, galur C. coccodes diisolasi menyang budaya murni.
Asil analisis sensitivitas sistem tes nuduhake manawa bisa digunakake kanggo diagnosa kanthi sukses ngarsane C. coccodes DNA ing sampel nalika total isi ing campuran PCR luwih saka 0.05 ng. Iki cukup cekap kanggo deteksi, amarga siji sclerotia ngemot rata-rata 0.131 ng, lan siji spora ngemot udakara 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Sistem tes sing dikembangake dening klompok Inggris (Cullen et al., 2002) nuduhake sensitivitas sing padha (siklus ambang 34 ing 0.05 ng DNA lan 37 ing 0.005 ng).
Analisis conto alami sing ngemot C. coccode ing kabeh kasus bisa dipercaya ngungkapake anané ing sampel (Tabel 2). Cara sing diusulkan kanggo isolasi DNA uga ditrapake kanggo analisis conto tanduran alami.
Tabel 2. Penentuan sensitivitas sistem tes sing diusulake kanggo ngenali coccode Colletotrichum kanggo PCR wektu nyata
Banjur | Jumlah DNA ing sampel *, ng | Siklus ambang | C. deteksi coccodes |
---|---|---|---|
Koncoku Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kulit umbi 1 | 50 | 32 | + |
Kulit umbi 2 | 50 | 30 | + |
Kulit umbi 3 | 50 | 31.5 | + |
Godhong kentang | 50 | 29.5 | + |
Cathetan * Ing campuran produk PCR.
Kekhususan sistem tes dipriksa ing sampel DNA sing diekstrak saka 15 spesies jamur. Kabeh galur jamur diisolasi dening panulis saka woh-wohan lan godhong tomat, ubi kentang sing kena pengaruh lan sehat; siji galur diisolasi saka oyot gandum (Tabel 1). Ing antarane spesies sing diisolasi saka permukaan woh, uga ana spesies sing ora patogen kanggo tomat (contone, Phellinus ferrugineovelutinus).
Panliten nunjukake yen C. coccodes DNA dideteksi ing siklus ambang 20-27, dene spesies jamur liyane ora dideteksi utawa menehi sinyal sawise siklus 40, sing bisa disebabake efek swara sing ora spesifik (Tabel 3).
Tabel 3. Tes sistem tes kanggo macem-macem jinis jamur
Jeneng jamur | Siklus ambang |
Coccodes koletotrichum 1 | 20.9 |
C. coccode 2 | 22.6 |
C. coccode 3 | 23 |
C. coccode 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. vertikalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Pholiopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineoveltinus | > 40 |
Vesicarium stemphylium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Kladosporio cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Cathetan * Jumlah DNA ing kabeh conto yaiku 10 ng.
Sistem tes sing dikembangake digunakake kanggo ngenali C. coccode ing conto godhong tomat kanthi gejala patogen nekrotrofik lan umbi kentang biji tanpa gejala sing bisa dideleng. Kanggo sinau, kita njupuk umbi-umbi wiji kanthi macem-macem jinis sing ditandur ing wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Anane C. coccodes DNA dianggep signifikan ing conto, ing analisis siklus ambang ora ngluwihi 35. Nilai ambang iki dipilih adhedhasar tekad sing bisa dipercaya yaiku 0.05 ng C. coccodes DNA (siklus ambang 33.5, Tabel 2) lan kasunyatane ing siklus ambang ndhuwur 40, DNA sing ora spesifik kanggo sawetara spesies jamur liyane didiagnosis. Kanthi pendekatan kasebut, anane wujud C. coccodes DNA dideteksi ing 5 conto tuber sing tuwuh ing wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga lan ing sawijining godhong tomat saka distrik Yeisk ing wilayah Krasnodar (Tabel 4, 5).
Tabel 4. Deteksi coccode Colletotrichum ing umbi kentang *
Nomer conto | Kentang macem-macem | Papan sing tuwuh | C. deteksi coccodes | Siklus ambang |
---|---|---|---|---|
1 | Abang Abang | Wilayah Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Wilayah Moskow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky awal | Wilayah Moskow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Wilayah Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasi | Wilayah Kaluga | - | |
15 | Gala | Wilayah Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Cathetan * Jumlah DNA ing kabeh conto yaiku 50 ng.
Tabel 5. Deteksi coccode Colletotrichum ing godhong tomat *
Nomer conto | Papan sing tuwuh | C. deteksi coccodes | Siklus ambang |
---|---|---|---|
1 | Wilayah Krasnodar, Kabupaten Crimean | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Wilayah Krasnodar, Distrik Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Jumlah DNA ing kabeh conto yaiku 50 ng.
Sistem tes sing digawe dening kita ora kalah karo sing dikembangake dening peneliti Inggris (Cullen et al., 2002) ing sensitivitas lan spesifisitas lan cocog kanggo analisis conto tanduran. Aplikasi kanggo analisis umbi wiji bisa dingerteni C. coccodes DNA ing umbi tanpa pratandha kerusakan eksternal lan kanthi sukses nganalisis infeksi godhong.
Nganti saiki, durung ana analisis umbi kentang kanggo infeksi C. coccode ing Rusia. Panliten kaping pisanan nuduhake yen saka 16 umbi wiji sing dites sing tuwuh ing macem-macem wilayah ing Federasi Rusia, 5 ngemot C. Iki nuduhake manawa ubi kentang ireng minangka penyakit kentang sing umum ing Rusia, lan peranane kanggo nyuda volume lan kualitas panen kentang ora diremehake.
Analisis godhong tomat nuduhake anane wujud C. coccodes DNA ing sawijining godhong saka distrik Yeisk, Wilayah Krasnodar. Sadurunge, nalika mriksa lapangan tomat ing Rusia kidul nggunakake sistem tes Inggris (Cullen et al., 2002), ditemokake godhong sing ngemot C. coccode, lan ing sawetara lapangan ditemokake proporsi godhong sing kena infeksi C. coccode (Belov et al., 2018). Ing Wilayah Krasnodar lan Primorsky, Wilayah Moskow, kita nemokake woh-wohan tomat, mula kita bisa ngisolasi budaya murni saka coccode C. Bisa uga C. coccode luwih nyebar ing tomat ing Rusia tinimbang saiki, lan mbebayani uga ora diremehake.
Mangkene, nganti saiki, cukup akeh informasi sing wis diklumpukake babagan nyebarake coccode C. ing kentang lan tomat.
Kanggo luwih ngerti peran jamur iki ing pangembangan penyakit kentang lan tomat, perlu ngawasi prevalensi ing Rusia, nyinaoni babagan infeksi lemah lan wiji, lan peran bintik-bintik ireng ing kerugian nalika disimpen. Panganggone diagnostik PCR bisa nggampangake karya iki, lan panggunaan sistem tes loro kanthi simultan bakal nambah akurasi analisis.
Karya iki didhukung dening hibah saka Yayasan Ilmu Rusia Nomer 18-76-00009.
Artikel kasebut diterbitake ing jurnal "Mycology and Phytopathology" (volume 54, No. 1, 2020).